En région endémique, le diagnostic de trypanosomose humaine africaine peut être établi sur les signes cliniques du stade neurologique. Cependant, le diagnostic est moins aisé au stade précoce de la maladie quand il n'y a pas d'anomalie biologique du liquide céphalorachidien (LCR). La mise en évidence du parasite, dans le suc ganglionnaire ou le sang, puis dans le LCR, est nécessaire à un diagnostic de certitude. Cette mise en évidence peut s'avérer difficile, surtout dans le cas d'infections à Trypanosoma brucei gambiense; elle dépend beaucoup de la sensibilité de la technique utilisée. Une dysglobulinémie devrait évoquer la recherche de trypanosomes. Les techniques de séro-immunologie sont des outils complémentaires indispensables. Aujourd'hui encore, la mise en évidence du parasite et/ou la recherche de perturbations du LCR (cytorachie, protéinorachie, présence d'immunoglobuline M) sont les seuls moyens permettant la distinction des deux stades de la maladie. C'est la raison pour laquelle la détermination du stade et le suivi post-thérapeutique nécessitent l'examen biologique du LCR. L'efficacité de la chimiothérapie est contrôlée par la disparition définitive des trypanosomes. Le suivi post-thérapeutique dure 2 ans, avec des visites régulières tous les 3 à 6 mois.

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