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Journal Français d'Ophtalmologie
Volume 33, n° 7
pages 505-524 (septembre 2010)
Doi : 10.1016/j.jfo.2010.06.018
Received : 24 June 2010 ;  accepted : 28 June 2010
Les conservateurs des collyres : vers une prise de conscience de leur toxicité
Preservatives in eye drops: Toward awareness of their toxicity
 

D. Vaede a, C. Baudouin b, c, , d , J.-M. Warnet a, b, F. Brignole-Baudouin a, b
a Laboratoire de toxicologie, faculté des sciences pharmaceutiques et biologiques, université Paris Descartes, 75006 Paris, France 
b Inserm, U968, UPMC université Paris 06, UMR S 968, institut de la vision, CNRS, UMR 7210, 75012 Paris, France 
c Service ophtalmologie III, centre hospitalier national d’ophtalmologie des Quinze-Vingts, 28, rue de Charenton, 75012 Paris, France 
d Université de Versailles St-Quentin, hôpital Ambroise-Paré, AP–HP, 9, avenue Charles-de-Gaulle, 92100 Boulogne, France 

Auteur correspondant.
Résumé

Les conservateurs sont présents dans de nombreux collyres multidoses. Ils assurent la stérilité de la solution vis-à-vis des bactéries et champignons. Cependant, des études ont montré que les conservateurs sont toxiques pour la surface oculaire notamment chez les patients prenant des collyres au long cours. Le conservateur le plus employé dans les collyres est le chlorure de benzalkonium, ammonium quaternaire utilisé comme détergent, antiseptique, désinfectant, fongicide, bactéricide et spermicide. Son utilisation sur la surface oculaire pourrait avoir des conséquences importantes en particulier sur le long terme. En effet, les conservateurs provoquent la dissolution du film lacrymal et sont pro-apoptotiques et pro-inflammatoires. L’administration prolongée de collyres contenant un ou plusieurs conservateurs conduit à une altération des structures superficielles (conjonctive, cornée) et plus profondes (trabéculum, cristallin). Les signes et symptômes oculaires les moins sévères se manifestent par une gêne ou des irritations : sensation de corps étranger de picotement ou brûlure, d’œil sec. Pour les effets secondaires les plus graves, on observe une inflammation d’intensité variable allant d’une simple réaction infraclinique au développement progressif d’une fibrose avec entre autres un risque accru d’échec en cas de chirurgie du glaucome. Le meilleur moyen de limiter ces complications passe par la réduction du nombre d’instillations de collyres conservés, et idéalement par l’utilisation de collyres sans conservateur, chaque fois que cela est possible. Une meilleure prise en charge de la surface oculaire devrait permettre d’augmenter le confort du patient, l’observance du traitement et d’assurer l’efficacité d’une future chirurgie filtrante chez les patients atteints de glaucome.

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Summary

Preservatives are present in numerous multidose eyedrops and provide the sterility of the solution against bacteria and fungi. However, numerous studies have shown their toxicity for the ocular surface, particularly in long-term treatments. The most widely used preservative in eyedrops is benzalkonium chloride. This quaternary ammonium acts as a detergent, antiseptic, disinfectant, fungicide, bactericide, and spermicide. Its use on the ocular surface therefore has significant consequences. Indeed, the preservatives are pro-apoptotic, pro-inflammatory and they cause the dissolution of the lachrymal film. The prolonged administration of one or several eye drops containing preservatives induces changes in the superficial structures (conjunctiva, cornea) as well as in deeper structures (trabecula, lens). The least severe symptoms are irritation and discomfort, including sensation of a foreign body, itching, or burning sensations. However, more severe side effects have been described, such as chronic inflammation of variable intensity or the progressive development of fibrosis with higher risk of failure after glaucoma filtering surgery. Ideally, preservative-free eyedrops should be recommended, or at least a reduction of the number of instilled preserved eyedrops should be considered. All these strategies could increase patient comfort, quality of life, and compliance, with better outcome at the time of filtering surgery.

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Mots clés : Glaucome, Collyres, Conservateurs, Benzalkonium, Toxicité, Surface oculaire

Keywords : Glaucoma, Eyedrops, Preservatives, Benzalkonium, Toxicity, Ocular surface


Introduction

Parmi les médicaments actuels, les préparations ophtalmiques occupent une place particulière tant par leur mode d’administration que par leur forme galénique. En effet, les préparations ophtalmiques sont instillées ou introduites dans l’œil ou mises en contact avec les paupières et doivent par conséquent être adaptées à cet usage. De ce fait, ce sont des solutions, suspensions et parfois crèmes ou pommades, contenues dans un conditionnement adapté tel que flacon en verre, flacon en plastique ou tube en aluminium. La composition de leur formulation doit être compatible avec la muqueuse oculaire, en particulier pour le pH et l’osmolarité, et le produit administré doit être exempt de particules étrangères susceptibles de provoquer des irritations ou des lésions de l’œil traité. La durée d’un traitement ophtalmique est très variable, de quelques jours à de longues années comme dans le cas du glaucome à angle ouvert. Quelle que soit la durée d’un traitement avec une préparation ophtalmique, la présence d’eau dans celle-ci la rend très sensible aux contaminations microbiennes tant bactériennes que fongiques. Cela est, bien sûr, d’autant plus vrai si l’on utilise le même flacon ou le même tube pendant plusieurs jours et que le conditionnement n’a pas été conçu pour empêcher toute pénétration d’air ou de toute autre substance après son ouverture. Les préparations ophtalmiques sont généralement stériles mais cela ne suffit pas pour éviter une contamination microbienne au cours de leur usage lors d’un traitement supérieur à une seule administration avec le même conditionnement. De ce fait, un grand nombre de préparations ophtalmiques contiennent des conservateurs. De plus, pour diminuer tout risque de contamination, même en présence de conservateurs dont l’efficacité n’est jamais absolue, les fabricants de produits ophtalmiques ont systématiquement limité la durée d’utilisation de ces produits à 15 ou 30 jours après leur ouverture. Néanmoins, dès lors que les gouttes sont utilisées fréquemment, les conservateurs peuvent avoir des conséquences sévères qui sont aujourd’hui assez bien documentées, dont entre autres le développement d’une hypersensibilité aux conservateurs chez des personnes prédisposées. L’utilisation fréquente des conservateurs a tendance à fragiliser la surface oculaire, la rendant susceptible de développer des phénomènes inflammatoires plus ou moins chroniques pouvant être graves à long terme [1]. D’où l’apparition chez certains utilisateurs, de signes cliniques fonctionnels à type de prurit, sensations de brûlure, de grains de sable, d’hyperhémie conjonctivale et de douleurs qui traduisent des conjonctivites ou kératoconjonctivites. Cette véritable maladie de la surface oculaire est potentiellement pourvoyeuse d’ulcérations cornéennes, de sécheresse oculaire ou de fibrose et peut mettre en jeu le pronostic visuel dans le temps. En outre, il ne faut pas oublier les facteurs environnementaux liés aux modes de vie actuels qui pourraient aggraver ou favoriser cette toxicité, tels que les ambiances sèches, les climatisations, le travail sur écran, le port de lentilles de contact, le tabac, la pollution… Cette revue rassemble et présente une grande partie des connaissances actuelles sur les conservateurs utilisés dans les collyres, et en premier lieu sur le chlorure de benzalkonium (BAC). Dans une première partie, les types et les modes d’action des conservateurs utilisés dans les préparations ophtalmiques seront décrits. Puis dans une seconde partie, un point sera fait sur la réglementation pharmaceutique en vigueur sur ces conservateurs. Dans une troisième partie, le conservateur de référence pour les préparations ophtalmiques, car le plus couramment utilisé, le BAC, sera traité en développant entre autres ses propriétés pharmacologiques, son mécanisme d’action, sa toxicité et ses effets indésirables.

Classification des conservateurs et modes d’action

Les conservateurs présents dans les préparations ophtalmiques se distinguent par leurs propriétés physicochimiques, leur compatibilité avec les autres constituants du collyre, leur spectre d’activité, leur pouvoir bactériostatique ou mieux bactéricide, leur virulence contre les espèces pathogènes, leur toxicité oculaire et leur pouvoir allergisant. Ils regroupent les ammoniums quaternaires, les dérivés organomercuriels, les amidines, les alcools et les complexes oxychlorés (Figure 1). Nous ajouterons volontairement à cette liste les parabens qui se trouvent principalement dans les produits cosmétiques mais qui peuvent intervenir sur la muqueuse oculaire par une application pouvant être proche de l’œil.



Figure 1


Figure 1. 

Formules chimiques des principaux conservateurs des collyres.

Zoom

Les ammoniums quaternaires

Les sels d’ammoniums quaternaires sont des composés chimiques constitués en général d’un atome d’azote substitué par quatre groupements comportant entre huit et 35 atomes de carbone. Parmi les ammoniums quaternaires, le BAC est le plus couramment utilisé. On trouve également dans les préparations ophtalmiques le bromure de cétrimonium (cétrimide), le bromure de benzododécinium, le chlorure de cétylpyridinium. Ce sont des composés bipolaires, très hydrosolubles, ayant des propriétés tensioactives (surfactants). Ils agissent principalement par leur activité détergente plus ou moins puissante conduisant à la dissolution des parois et membranes bactériennes, à la destruction de la couche semi-perméable cytoplasmique et au relargage du contenu intracellulaire [2, 3].

Leur pouvoir bactéricide est rapide et augmente à 37°C en milieu alcalin. Le BAC est habituellement utilisé à des concentrations situées entre 0,004 % et 0,02 %. Le spectre d’action est surtout orienté sur les bactéries Gram positives (Staphylococcus ) même à très faible concentration. En association à l’EDTA à 0,1 %, son activité contre les bactéries Gram négatives (P. aeruginosa ) est augmentée. Les ammoniums quaternaires sont aussi d’excellents fongicides, particulièrement actifs sur Candida albicans et Aspergillus fumigatus . Enfin, les ammoniums quaternaires sont de puissants spermicides et sont utilisés, en dehors des préparations ophtalmiques, dans toute sorte de produits d’usage courant (savons, cosmétiques, produits de nettoyage, désinfectants…).

Le polyquaternium-1 (Polyquad®) bien qu’appartenant également à la famille des ammoniums quaternaires doit en être différencié par l’absence de propriétés détergentes et un profil toxicologique beaucoup plus favorable. Grosse molécule pénétrant peu ou pas dans les cellules eucaryotes, cet agent garde cependant une action antiseptique puissante même à très faible concentration. Il est ainsi utilisé comme agent décontaminant des lentilles de contact ou comme conservateur dans certains collyres à une concentration de 0,001 % (contre 0,004 % à 0,02 % pour le BAC), avec un niveau de toxicité très faible à cette concentration, ce qui en fait agent de conservation potentiellement intéressant pour les collyres à usage chronique [4]. Son développement est en cours en Europe comme alternative au BAC.

Les dérivés organomercuriels

Ce sont le phénylmercure (acétate, borate ou nitrate), le mercurobutol et le mercurothiolate sodique (thiomersal ou thimerosal). Ils sont efficaces grâce aux propriétés thioloprives de l’ion mercuriel. Ils agissent par combinaison avec les groupements sulfhydryles des protéines et précipitent les protéines bactériennes par formation de protéinates de mercure. Leur spectre d’activité est celui des germes utilisant dans leur métabolisme une enzyme du groupement sulfhydryle, en particulier les bactéries Gram positives et les germes non sporulants. Le thimerosal reste le seul actuellement utilisé car il est responsable de moins d’effets secondaires [5]. En fait l’application chronique de sel de phénylmercure peut se compliquer de l’apparition d’une coloration grise irréversible du cristallin, signe d’imprégnation mercurielle, ou d’une kératopathie en bandelette (dépôts mercuriels au niveau de la couche de Bowman). De plus, le thiomersal est le plus stable des trois composés cités. Les concentrations usuelles sont situées entre 0,001 et 0,004 %. Il est surtout actif en milieu faiblement acide. Ces conservateurs ont été progressivement éliminés des collyres modernes en raison d’allergies fréquentes. En outre, la réglementation actuelle interdit désormais l’utilisation de ces dérivés du mercure.

Les amidines

Le principal agent utilisé est la chlorhexidine, agent cationique appartenant à la famille des bis-diguanides. Elle est utilisée sous forme de digluconate soluble dans l’eau et est active en milieu neutre ou légèrement alcalin (pH 8). Le gluconate de chlorhexidine est incompatible avec des savons, des détergents et des composés anioniques qui annulent son action. Elle agit en détruisant la couche semi-perméable des membranes cytoplasmiques. Elle inhibe le transport transmembranaire des cations et l’hydrolyse de l’ATP membranaire. En outre, elle retarde la germination des spores des bactéries. Son activité antimicrobienne s’exerce surtout à l’encontre des cocci et bacilles Gram positifs et de certaines bactéries Gram négatives. Les bactéries les plus résistantes sont Serratia , Proteus et Pseudomonas . Elle possède également une activité fongistatique. Elle est peu active sur Mycobacterium tuberculosis et n’est ni sporicide, ni virucide. La chlorhexidine a été synthétisée pour la première fois en 1950 au Royaume-Uni pendant les recherches sur le proguanil, un agent antipaludéen [6]. Cette molécule est peu allergisante et n’est pas absorbée à travers la peau saine. En dehors de son utilisation dans les collyres (à 0,005 ou à 0,01 %), elle entre aussi dans la composition des produits d’entretien des lentilles de contact et, à une forte concentration (4 %), est employée comme désinfectant en préopératoire pour la désinfection des mains et de la peau. Il est néanmoins préconisé d’éviter son utilisation dans la région péri-orbitaire car, à cette concentration, elle exerce une action toxique importante sur la cornée, source potentielle d’une kératopathie grave avec éventuelle néovascularisation [7, 8].

Les alcools

Seuls le chlorobutanol et le phényléthanol sont utilisés comme conservateurs en ophtalmologie. Le chlorobutanol agit en augmentant la solubilité lipidique et son activité antimicrobienne est basée sur sa capacité à traverser la couche lipidique bactérienne. Aux concentrations usuelles (0,2–0,5 %), il possède une activité bactériostatique et antifongique. Il est actif à la fois sur les Gram positifs et Gram négatifs (P. aeruginosa ) et C. albicans . Le phényléthanol est peu actif mais il a une action synergique en association avec d’autres conservateurs (chlorobutanol, BAC, chlorhexidine).

Les parabens

Les parabens sont des esters de l’acide parahydroxybenzoïque. On distingue le méthylparaben (E218), l’éthylparaben (E214), le propylparaben (E216), l’isopropylparaben, le butylparaben et l’isobutylparaben. Leur activité s’exerce davantage contre les moisissures ou les champignons que contre les bactéries, les plus sensibles étant les Gram positifs. Les parabens sont utilisés dans plus de 450 produits cosmétiques tels que crèmes de soin, dentifrices, shampoings, laits de toilette, fonds de teint, mascaras ou mousses à raser. Ils sont également utilisés comme conservateurs dans l’industrie alimentaire. Certains d’entre eux sont présents dans la nature comme le méthyparaben dans les myrtilles, mais pour les cosmétiques ils sont fabriqués à partir d’acide benzoïque et sont souvent dilués dans un solvant : le phénoxyéthanol, qui est lui-même un conservateur. Ce sont des allergisants relativement modérés. La concentration maximale autorisée est de 0,4 % pour chacun des parabens, le total de tous les parabens d’un même produit ne pouvant dépasser 0,8 % (calculé en masse d’ester). En 2004, une étude avait révélé la présence de parabens dans des tissus mammaires cancéreux sans pouvoir cependant conclure à l’existence d’un lien de cause à effet entre la présence de parabens et le développement du cancer du sein [9]. Toutefois, certains parabens ont tout de même des effets oestrogéniques bien documentés dans de nombreuses publications [10]. Le propylparaben, quant à lui, à faible dose, induit une réduction de la production de spermatozoïdes. Ainsi, l’European Food Safety Authority (EFSA), dans un avis sur la sécurité de l’utilisation des parabens (additifs E214 et E219) dans les produits alimentaires (EFSA, 2004), n’a pu recommander de dose journalière admissible (DJA) pour le propylparaben en raison du manque de no observed adverse effect level (NOAEL) pour cet effet. En outre, le méthylparaben appliqué sur la peau, à la concentration trouvée dans les produits cosmétiques, accélérait le vieillissement cutané en synergie avec une exposition solaire [11].

Les complexes oxychlorés

D’usage plus récent, les conservateurs oxydants, comme les complexes oxychlorés stabilisés, sont de petites molécules qui pénètrent facilement à l’intérieur des membranes et altèrent les fonctions cellulaires en modifiant les lipides, les protéines ou l’ADN. Les complexes oxychlorés stabilisés sont composés principalement de chlorite (NaClO2, Purite®), d’une faible proportion de chlorates et de traces de chlore. Le chlorite agit en produisant une forte oxydation du glutathion, diminuant ainsi les défenses cellulaires contre le stress oxydant. Il est donc particulièrement efficace contre les espèces contenant peu de glutathion telles que S. aureus . En revanche, il est moins efficace contre P. aeruginosa , C.  albicans et Alternaria alternata [12].

Le perborate de sodium (GenAqua®)

Le perborate de sodium a été l’un des premiers conservateurs de type oxydant introduit dans les collyres. Il altère la synthèse protéique des bactéries en oxydant leurs membranes et inhibant ainsi les enzymes liées à celles-ci. En milieu aqueux, il est transformé en eau, oxygène et H2 O2  qui tue les microbes, notamment A. niger [13].

Le système Sofzia®

Le système de conservation Sofzia® est composé d’acide borique, de propylène glycol, de sorbitol et de chlorure de zinc. La FDA a approuvé une formulation de travoprost conservée avec ce système en 2006. Cette formulation, malgré l’absence d’ammonium quaternaire supposé améliorer la pénétration de la molécule active, réduit la pression intraoculaire jusqu’à 8,5mm de mercure démontrant une équivalence statistique avec le traitement original contenant du BAC [14]. Le système protecteur Sofzia® est robuste et résiste aux agressions d’un fort taux de pathogènes oculaires tels que S. aureus , P. aeruginosa , Escherichia coli , C. albicans et A. niger . Il semble non toxique sur plusieurs modèles expérimentaux [15, 16]. Cependant un effet conservateur légèrement inférieur à celui des ammoniums quaternaires fait que ce concept n’est pas autorisé en Europe, malgré son avantage potentiel d’absence de toxicité lors d’une utilisation prolongée.

Réglementation des conservateurs en ophtalmologie

La Pharmacopée recommande que les collyres contiennent un agent antimicrobien (conservateur) pour éviter la prolifération ou limiter la contamination microbienne qui, après ouverture du flacon, pourrait être la cause d’un risque d’infection pour le malade et d’une détérioration de la préparation. Une telle contamination des collyres se fait essentiellement par les mains lors de la manipulation ou par contact si l’embout touche les paupières, les cils, la conjonctive ou les larmes. Il y a aussi un risque de transmission croisée lorsque le même collyre est utilisé par plusieurs patients, notamment en milieu hospitalier ou au sein d’une même famille. La contamination bactérienne oculaire peut avoir des conséquences graves allant jusqu’à la perforation de l’œil et à sa perte, avec risque d’énucléation. C’est d’ailleurs à la suite d’incidents de ce type survenus dans les années 1960 dans un hôpital de Birmingham que les autorités britanniques ont incité l’industrie à développer les premières monodoses et à limiter la durée d’utilisation après ouverture. À partir de 1960, les progrès les plus nets ont été réalisés dans le domaine de la mise au point des conservateurs. Mais l’obligation de mettre un agent antimicrobien dans toute préparation ophtalmique multidose n’est apparue que dans les années 1970. Un agent antimicrobien « idéal » devrait posséder les propriétés suivantes : avoir un spectre d’activité très large, être bactéricide ou bactériostatique, ne pas être irritant ou toxique pour les tissus oculaires, être compatible avec les constituants de la préparation et avec le récipient, être stable et thermorésistant [17].

Les préparations ophtalmiques

Les préparations ophtalmiques sont des préparations stériles, liquides, semi-solides ou solides destinées à être appliquées sur le globe oculaire et/ou sur les conjonctives, ou à être introduites dans le sac conjonctival. Plusieurs catégories peuvent être distinguées : les collyres, les solutions pour lavage ophtalmique, les poudres pour collyres et les poudres pour solutions pour lavage ophtalmiques, les préparations ophtalmiques semi-solides et les inserts ophtalmiques. Au cours du développement des préparations ophtalmiques dont la formulation comporte un conservateur antimicrobien, la nécessité et l’efficacité du conservateur choisi doivent être démontrées de manière à satisfaire l’Autorité compétente. Le texte « Efficacité de la conservation antimicrobienne » se trouvant dans la rubrique 5.1.3 de la Pharmacopée européenne (édition 6.6), décrit une méthode d’essai appropriée et indique des critères d’évaluation des propriétés antimicrobiennes de la formulation. Les préparations ophtalmiques sont préparées à partir de produits et par des méthodes propres à assurer leur stérilité et à empêcher l’introduction de contaminants et la croissance de microorganismes ; des recommandations sont fournies à cet égard dans le texte « Méthodes de préparations de produits stériles » se trouvant dans la rubrique 5.1.1 de la Pharmacopée européenne . Lors de la fabrication des préparations ophtalmiques contenant des particules en dispersion, des mesures sont prises pour assurer que la taille des particules est convenablement contrôlée et qu’elle est appropriée à l’usage prévu de la préparation. Sauf indication contraire, les préparations ophtalmiques doivent être conservées en récipient stérile, étanche et à fermeture inviolable. L’étiquette doit indiquer le nom de tout conservateur antimicrobien éventuellement ajouté. Ainsi que le précise la Pharmacopée européenne , les collyres, les solutions pour lavage ophtalmique, les poudres pour collyre et les poudres pour solutions pour lavage ophtalmique peuvent contenir des excipients destinés, par exemple, à ajuster le pouvoir osmotique ou la viscosité de la préparation, à adapter ou stabiliser le pH, à augmenter la solubilité de la substance active ou à stabiliser la préparation. Ces excipients ne doivent pas nuire à l’action médicamenteuse recherchée et aux concentrations choisies, ne doivent pas provoquer d’irritation locale notable. Les collyres et les solutions pour lavage ophtalmique conditionnés en récipients multidoses contiennent un conservateur antimicrobien approprié à concentration convenable, sauf si la préparation présente elle-même des propriétés antimicrobiennes adéquates. Les récipients multidoses sont conçus pour permettre plusieurs prélèvements de la solution qu’ils contiennent. Le conservateur antimicrobien choisi doit être compatible avec les composants de la préparation et garder son efficacité jusqu’à la fin de la durée d’utilisation du collyre ou de la solution. Si les collyres ou les solutions pour lavages ophtalmiques sont prescrits sans conservateur antimicrobien, ils sont, autant que possible, conditionnés en récipients unidoses. Les collyres et les solutions pour lavages ophtalmiques utilisés au cours d’interventions chirurgicales ne contiennent pas de conservateurs antimicrobiens et sont conditionnés en récipients unidoses. Les collyres qui se présentent sous forme de solutions ou les solutions pour lavage ophtalmique, examinés dans des conditions appropriées de visibilité, sont pratiquement limpides et exempts de particules. Pour les collyres, les solutions pour lavage ophtalmique et les préparations ophtalmiques semi-solides, l’étiquette doit indiquer, dans le cas des récipients multidoses, la durée limite d’utilisation à partir de l’ouverture du récipient, qui ne doit pas dépasser quatre semaines, sauf exception justifiée et autorisée.

Test d’efficacité de la conservation antimicrobienne

L’essai d’efficacité réglementaire consiste en la contamination artificielle de la préparation, si possible dans son récipient définitif, au moyen d’un inoculum de microorganismes, au maintien de cette préparation à une température prescrite et au prélèvement d’échantillons à partir du récipient à intervalles de temps donnés pour dénombrement des organismes dans ceux-ci. Les propriétés de conservation de la préparation sont adéquates si, dans les conditions de l’essai, il a été constaté une diminution importante ou une absence d’augmentation du nombre de microorganismes dans la préparation ensemencée. Les critères d’acceptation, en termes de diminution du nombre de microorganismes en fonction du temps, varient pour les diverses catégories de préparations, selon le degré de protection recherché (Tableau 1). Les microorganismes d’essai sont P. aeruginosa , S. aureus , C. albicans et A. niger . Les essais sont effectués avec des souches uniques. Aux microorganismes prescrits peuvent être ajoutées, dans les cas appropriés, d’autres souches ou espèces qui peuvent représenter des contaminants potentiels de la préparation.

Préparation de l’inoculum

Avant l’essai, il faut ensemencer la surface d’un milieu gélosé B (paragraphe 2.6.12 de la Pharmacopée européenne ) pour les bactéries ou celle d’un milieu gélosé C sans addition d’antibiotique (paragraphe 2.6.12 de la Pharmacopée européenne ) pour les champignons avec la culture mère récemment obtenue de chacun des microorganismes spécifiés. Puis, il faut incuber les cultures bactériennes à une température de 30–35°C pendant 18-24 heures sauf la culture de C. albicans qui doit être incubée à une température de 20–25°C pendant 48 heures et la culture d’A. niger à une température de 20–25°C pendant une semaine ou jusqu’à obtention d’une sporulation satisfaisante. Des subcultures peuvent être nécessaires après reprise des microorganismes, avant qu’ils n’atteignent leur état optimal, mais il est recommandé de maintenir au minimum le nombre de repiquages. Pour récolter les cultures bactériennes et de C. albicans , il faut utiliser un liquide de suspension stérile contenant 9g/l de chlorure de sodium et disperser la culture développée en surface dans un récipient approprié. Ensuite, il faut ajuster le nombre de microorganismes à environ 108 par millilitre.

Pour récolter la culture d’A. niger, il faut utiliser un liquide de suspension stérile contenant 9g/l de chlorure de sodium et 0,5g/l de polysorbate et il faut ajuster de même le nombre des spores à environ 108 par millilitre avec la même solution. On prélève immédiatement un échantillon approprié de chaque suspension et on détermine le nombre d’unités formant colonies par millilitre dans chaque suspension par dénombrement sur plaques ou par filtration sur membrane. Ce chiffre sert à déterminer l’inoculum et le niveau de base à employer dans l’essai. Les suspensions doivent être utilisées immédiatement.

Procédé

Pour le dénombrement des microorganismes viables dans les préparations ensemencées, on utilise le même milieu gélosé que celui employé dans la culture initiale du microorganisme correspondant. On ensemence une série de récipients du produit à examiner avec une suspension de l’un des microorganismes d’essais afin d’obtenir un inoculum de 105 à 106 microorganismes par millilitre ou par gramme de préparation. Le volume de la suspension de l’inoculum ne dépasse pas 1 % du volume du produit. On mélange soigneusement pour assurer une répartition homogène et on maintient le produit ensemencé à une température de 20-25°C à l’abri de la lumière. Puis on prélève des échantillons appropriés de chacun récipient, par exemple 1ml ou 1g, au temps zéro et aux intervalles appropriés, selon le type de préparation, et il faut déterminer le nombre de microorganismes viables par dénombrement sur plaques ou par filtration sur membrane en vérifiant que toute activité microbienne résiduelle dans la préparation est éliminée par dilution, par filtration ou par l’utilisation d’un neutralisant spécifique. Lorsque des procédés de dilution sont utilisés, il faut tenir compte de la réduction de la sensibilité dans la détection de petits nombres de microorganismes viables. Lorsqu’un neutralisant spécifique est utilisé, la capacité du système à permettre la croissance des microorganismes d’essai est confirmée à l’aide de contrôles appropriés.

Critères d’acceptation

Les critères pour l’évaluation de l’activité antimicrobienne sont donnés dans le Tableau 1 en termes de réduction logarithmique du nombre de microorganismes viables par rapport à la valeur obtenue pour l’inoculum.

Le conservateur de référence : le BAC.

Structure chimique, mode d’action

Le BAC est un mélange de chlorure d’alkylbenzyldiméthylammonium de formule générale : C6 H5 CH2 N(CH3 )2 RCl, R représentant des radicaux alkyles de C8 à C18. L’homologue BAC-C12 est appelé le chlorure de benzododécinium, l’homologue BAC-C14, le chlorure de myristalkonium et l’homologue BAC-C16, le chlorure de cétalkonium.

Propriétés physiques

Le BAC peut se présenter sous forme de poudre amorphe, de paillettes gélatineuses ou de gel épais de couleur blanche à jaunâtre, très hygroscopique, d’odeur légèrement aromatique. Il est livré le plus souvent en solution aqueuse à 50 % ou en solution hydroalcoolique 80 % (isopranolol/eau ; parfois éthanol/eau), formes sous lesquelles il est produit par l’industrie [18]. Il est très soluble dans l’eau, l’alcool et l’acétone, légèrement soluble dans le benzène et pratiquement insoluble dans l’éther. Les solutions aqueuses ont une faible tension de surface et présentent des propriétés détergentes et émulsifiantes, moussant abondamment lorsqu’elles sont agitées.

Utilisations

Les utilisations du BAC sont très nombreuses et sont présentes dans le Tableau 2.

Propriétés pharmacologiques

Le BAC est un antiseptique, émulsifiant, spermicide et virucide. Le BAC est aussi un tensioactif ou agent de surface ou surfactant c’est-à-dire un composé qui modifie la tension superficielle entre deux surfaces (tension qui existe à la surface de séparation de deux milieux). Les composés tensioactifs sont des molécules amphiphiles, c’est-à-dire présentant deux parties de polarité différentes, l’une lipophile, miscible dans l’huile et apolaire, l’autre hydrophile, miscible dans l’eau et polaire. Le BAC est un tensioactif cationique, sa partie hydrophile NH4 + est chargée positivement. Il libère ainsi une charge positive (cation) en solution aqueuse. La concentration micellaire critique du BAC est de 0,02 %. La concentration micellaire critique est, par définition, la concentration de l’agent tensioactif en solution au-dessus de laquelle une partie des molécules dispersées dans la solution se rassemble sous forme de micelles.

Mécanismes d’action

Le BAC exerce son action antibactérienne grâce à plusieurs mécanismes [19]. Il est responsable de la dénaturation plus ou moins sélective de protéines ou d’enzymes de la bactérie, par solubilisation et dépolymérisation. Cela va entraîner l’inactivation d’enzymes intervenant dans la respiration et la glycolyse et l’inactivation de déshydrogénases. Cette inactivation enzymatique peut être réversible en début d’action, mais devient définitive après un contact prolongé. Le BAC peut aussi se fixer au niveau des ribosomes et entraîner l’arrêt de la synthèse protéique. Il peut lyser la membrane cellulaire provoquant une perturbation des échanges osmotiques. Il s’adsorbe à la surface des cellules chargées négativement qu’il neutralise et entraîne des changements de perméabilité puis des lésions de la membrane. Au niveau physiologique, sont observées une baisse de l’activité mitotique et de la migration cellulaire à l’origine des retards de cicatrisation, une altération du potentiel électrique et une lyse cellulaire accrue [20, 21].

Le BAC est un agent tensioactif cationique bactériostatique plus actif contre les bactéries Gram positives que contre les bactéries Gram négatives. Il est inactif contre les mycobactéries, faiblement fongistatique et virucide. Chaque homologue dans cette famille de composés a différentes propriétés biocides, chimiques et physiques en relation avec la longueur de la chaîne alkyle. En général, l’homologue BAC-C12 est le plus efficace contre les levures ou champignons, l’homologue BAC-C14 contre les bactéries Gram positives et l’homologue BAC-C16 contre les bactéries Gram négatives. Son action antiseptique à faible concentration dépend de la longueur de la chaîne hydrocarbonée. Elle est maximale pour les molécules en C14 et minimale pour les chaînes contenant huit et 18 atomes de carbone [22]. Cependant, à l’heure actuelle, la composition précise du BAC utilisé dans les collyres n’est jamais précisée. Il s’agit d’un mélange de différentes formulations de BAC où deux composés dominent : les chaînes en C12 et celles en C14 [21]. L’activité antimicrobienne varie selon les conditions, les facteurs favorisants sont un pH alcalin et une température à 37°C. Elle est annihilée par les composés anioniques (savons), les eaux dures, les matières organiques (sang, pus) et certains composés non ioniques.

Pharmacocinétique

Le BAC est absorbé rapidement par le tractus gastro-intestinal, mais en quantité faible, et peu par la peau avec des variations individuelles importantes. Il diffuse dans le foie, les poumons et les reins. Les taux sanguins et tissulaire restent constants pendant 24 heures après exposition orale chez le rat avec un taux croissant du sang au foie, aux poumons et aux reins [18]. Après injection intraveineuse ou intra-artérielle, la concentration sanguine chute rapidement après 30minutes, puis se stabilise ; la demi-vie sanguine est comprise entre 1h30 et 2h. Les concentrations pulmonaire et rénale sont 10 fois supérieures à celle du sang suggérant pour ces organes, un rôle de réservoir et de cible. Le BAC est éliminé lentement dans l’urine et les fèces sans métabolisation préalable.

Génotoxicité

Les dangers génétiques potentiels du BAC ont pu être rapportés grâce au test d’Ames qui consiste à examiner la survenue de mutations spécifiques chez différentes souches de Salmonella typhimurium au test d’électrophorèse sur gel d’ADN des hépatocytes de rat et au test du micronoyau sur lymphocytes humains et sur des cellules de racine de Vicia faba . Une induction significative de la migration de l’ADN a été détectée dans les cellules de foie pour du BAC à 1mg/l ou 10−4 % [23]. Pour mémoire la concentration commune utilisée dans les collyres est de 10−2 %. Le test du micronoyau est positif pour des concentrations de BAC de 1 et 3mg/l. Le BAC peut provoquer des inductions significatives de micronoyaux aussi bien que des inhibitions des divisions cellulaires dans les cellules de plantes, le taux efficace le plus faible est de 10mg/l de BAC (10−3 %). Les résultats de cette étude montrent que le BAC induit des effets génotoxiques modérés mais significatifs chez les cellules eucaryotes aux concentrations qui sont trouvées dans les eaux usées, leur libération dans l’environnement pouvant causer des altérations génétiques chez les organismes exposés. Des effets génotoxiques et cytotoxiques de BAC dans les cellules épithéliales respiratoires humaines en culture ont été mis en évidence après exposition pendant 2 heures à des concentrations de BAC allant de 0,002 à 0,05 % [24]. Le tail moment (évaluation de la taille et de l’intensité de fluorescence des comètes et de leur queue) d’une électrophorèse de cellules isolées sur gel a été utilisé pour évaluer les dommages de l’ADN induit par le BAC. Le tail moment augmenta de façon dose-dépendante avec une valeur maximale de 0,02 % et déclina pour des concentrations de BAC plus fortes. Presque toutes les cellules mourraient pour des faibles concentrations de BAC jusqu’à 0,01 %. Au-dessus de cette concentration, la viabilité cellulaire augmentait, probablement en raison du passage à la concentration micellaire critique du BAC, estimée a 0,02 % dans du PBS.

Toxicité aiguë chez l’homme [18]

Les principaux effets du BAC sont liés à l’action corrosive de la substance concentrée. Des cas d’empoisonnement fatal par du BAC ont été décrits chez cinq personnes âgées souffrant de démence sénile ayant ingéré accidentellement une solution de BAC à 10 % [25]. L’ingestion produit une sensation immédiate de brûlure dans la bouche, la gorge puis l’abdomen ainsi qu’une hypersalivation. Par la suite, surviennent agitation, angoisse et confusion associées à une atteinte musculaire traduite par des fasciculations. Dans les cas les plus sévères, on peut observer une dépression du système nerveux central avec ou sans convulsions. L’atteinte musculaire peut conduire à un arrêt respiratoire fatal. Des signes d’hypotension parfois sérieux peuvent se compliquer d’une insuffisance rénale, d’une acidose métabolique et d’une cytolyse hépatique avec augmentation des ALAT et des ASAT. Des lésions d’irritation sont observées sur les tissus du tube digestif. Le chlorure BAC provoque des irritations de la peau, des yeux et des muqueuses respiratoires. Les solutions concentrées peuvent entraîner une nécrose cutanée ; des solutions à 10 % sont déjà irritantes pour la peau. Au niveau de l’œil, des concentrations de 0,1 à 0,5 % peuvent entraîner des conjonctivites graves. A partir de 10 %, l’atteinte de la cornée est redoutable.

Toxicité chronique [18]

Elle est dominée par la survenue de manifestations allergiques. En cas d’utilisation répétée de préparations topiques contenant du BAC peuvent survenir des allergies cutanées. De rares cas d’asthme professionnel aux ammoniums quaternaires, dont le BAC ont été décrits particulièrement chez des personnes effectuant des désinfections, notamment par pulvérisations en milieu hospitalier, et des tests de provocation bronchique peuvent être positifs. Quelques études indiquent que l’emploi chronique de sprays nasaux à base de BAC dont la concentration ne dépasse pas 0,1 %, favoriserait l’apparition d’une rhinite médicamenteuse chez des sujets souffrant de rhinite allergique, le rôle des autres composants de ces traitements ne pouvant être toutefois totalement exclu.

Hygiène et sécurité du travail

Les travaux de désinfection et de stérilisation exposant à des émanations de chlorhexidine, d’hexachlorophène, de benzisothiazoline-3-one et ses dérivés, d’organomercuriels, d’ammoniums quaternaires et leurs dérivés, notamment le benzalkonium et le chlorure de lauryldiméthylbenzylammonium sont classés dans le tableau n° 66 des maladies professionnelles (rhinite et asthmes professionnels) d’après le décret n° 2003-110 du 11 février 2003 révisant et complétant les tableaux des maladies professionnelles annexés au livre IV du code de la sécurité sociale [18].

Classification et étiquetage

Le BAC correspond à la classification suivante : R21/22 Nocif par contact avec la peau et par ingestion , R34 Provoque des brûlures et R50 Très toxique pour les organismes aquatiques d’après l’arrêté du 8 octobre 1999 (JORF du 16 octobre 1999) modifiant l’arrêté du 20 avril 1994 (JORF du 8 mai 1994). Ces risques doivent être mentionnés sur l’étiquetage qui doit aussi indiquer les conseils de prudence suivants : S24/25 Éviter le contact avec la peau et les yeux , S26 En cas de contact avec les yeux, laver immédiatement et abondamment avec de l’eau et consulter un spécialiste , S36/37/39 Porter des vêtements de protection appropriés, des gants et un appareil de protection des yeux et du visage , S45 En cas d’accident ou de malaise, consulter immédiatement un médecin (si possible lui montrer l’étiquette) , S61 Eviter le rejet dans l’environnement [18].

Effets du BAC utilisé hors ophtalmologie et impact sur l’environnement
Rhinite médicamenteuse

La rhinite médicamenteuse est définie comme une hyperactivité nasale avec un gonflement des muqueuses. Elle consiste en l’apparition de signes de rhinite induits par la prise de médicament, par voie générale ou nasale. Il s’agit parfois de l’effet secondaire d’un traitement institué pour une autre pathologie. La plus connue est la rhinite aux décongestionnants nasaux qui succède à l’abus de décongestionnants topiques alpha-mimétiques essentiellement les dérivés de l’oxymétazoline et de la phényléphrine. Graf et al. [26] décrivirent dans ce cadre les effets indésirables biologiques du BAC en définissant le mécanisme responsable des rhinites médicamenteuses par utilisation abusive de décongestionnant vasoactif. L’ajout de BAC comme conservateur dans les décongestionnants nasaux conduit à l’aggravation de la rhinite. Une étude a comparé les effets de cinq conservateurs sur la fréquence des battements ciliaires de cellules épithéliales nasales humaines : BAC, alcool phényléthylique, méthylparaben, propylparaben et chlorbutol [27]. Le méthylparaben (0,0033 %), le propylparaben (0,0017 %) et le chlorbutol (0,005 %) n’ont pas eu d’effet ni après une exposition de courte durée ni après une exposition de longue durée. En revanche, l’exposition à long terme à l’alcool phényléthylique (0,125 %) ou à l’association de méthyl/propylparaben (0,033/0,017 %) et au BAC (0,001 %) a diminué significativement la fréquence des battements ciliaires de manière irréversible pour ce dernier. Cette toxicité du BAC dans les solutions nasales a été confirmée in vitro [28].

Action spermicide

Le BAC est présent dans la composition de certains médicaments contraceptifs locaux. Le BAC est un surfactant détruisant les spermatozoïdes par déséquilibre osmotique. Il provoque la rupture de la membrane du spermatozoïde et sa destruction s’effectue en deux temps, d’abord par la destruction du flagelle, puis par éclatement de la tête. L’efficacité théorique évaluée au laboratoire est de 100 %, car toute vie spermatozoïdaire est impossible en présence du principe actif, même à l’état de traces.

Résistance des bactéries [29]

L’utilisation large des ammoniums quaternaires dans l’industrie et la cosmétologie a été accusée depuis plusieurs années de favoriser des résistances croisées avec des antibiotiques ou d’autres antiseptiques, ce qui pourrait constituer à terme un grave problème de santé publique [30]. P. aeruginosa est un germe ubiquitaire dans l’environnement qui montre une résistance intrinsèque pour des taux élevés d’ammoniums quaternaires. Cette résistance est due à sa membrane cellulaire. Par exemple, les antibiotiques ne peuvent pas accéder facilement au niveau de leur site d’action en raison d’une faible perméabilité de la membrane extérieure, et les pompes d’efflux provoquent une augmentation de l’efflux des agents antimicrobiens. Les changements phénotypiques des P. aeruginosa correspondant à l’augmentation du taux de résistance aux ammoniums quaternaires ont fait l’objet de nombreux travaux. Ces changements phénotypiques sont des modifications des protéines de la membrane extérieure, des modifications des acides gras, des lipides, des lipopolysaccharides, de la paroi cellulaire et de l’hydrophobicité de la surface cellulaire. La fréquente utilisation des désinfectants dans l’environnement alimentaire a augmenté les inquiétudes quant à l’émergence possible de cas isolés de résistance aux désinfectants. Des résistances aux ammoniums quaternaires ont été rapportées avec de nombreuses bactéries Gram positives et Gram négatives associées à la nourriture. Les systèmes d’efflux actifs jouent un rôle important dans la résistance des bactéries aux antibiotiques. Ces systèmes sont des transporteurs membranaires dont la fonction est de rejeter à l’extérieur des composés toxiques pour la cellule. Ce sont surtout les systèmes d’efflux Multi-Drug Resistant (MDR) qui sont préoccupants, dans la mesure où ils sont à large spectre. Ces systèmes, naturellement présents chez tous les procaryotes, peuvent être surexprimés sous l’effet de mutations dans le(s) gène(s) de régulation, conduisant à une multirésistance. Même lorsque cette résistance est faible, elle peut faciliter l’émergence de mutants hautement résistants. La découverte d’inhibiteurs des pompes d’efflux (EPI pour efflux pumps inhibitors ) permettant de restaurer la sensibilité aux antibiotiques de ces souches hyperproductrices est une voie de recherche essentielle en chimiothérapie anti-infectieuse.

Il a été montré qu’un mécanisme de pompe d’efflux similaire peut être induit par le BAC chez certaines souches de Listeria monocytogenes [31]. Deux pompes d’efflux ont été trouvées chez Listeria monocytogenes  : MdrL qui peut expulser des antibiotiques (macrolides et céfotaxime), des métaux lourds et le bromure d’éthidium, et Lde, qui est impliquée dans la résistance aux fluoroquinolones, à l’acridine orange et au bromure d’éthidium. L’adaptation des souches naturellement sensibles de Listeria monocytogenes aux ammoniums quaternaires est en partie due à la superexpression de la pompe d’efflux MdrL. Des souches sensibles au BAC (CMI<1mg/l) ont été adaptées au BAC au bout de deux à trois semaines (30). L’adaptation au BAC a conduit à une augmentation de deux à quatre fois la CMI aux antibiotiques gentamicine, kanamycine, ainsi qu’au désinfectant Clinicide® (mélange de deux ammoniums quaternaires 60 % de chlorure de didécyl diméthylammonium et 40 % de BAC, MTC Animal Health, Cambridge, ON, Canada), et au chlorure de myristalkonium, un autre ammonium quaternaire. Une des souches adaptées a également révélé une augmentation de sa résistance à l’acide acétique (CMI×4) et au peroxyde d’hydrogène (CMI×2).

Impact sur les espèces aquatiques

La quantité de BAC trouvée dans l’environnement est considérable, en raison d’un grand nombre de produits contenant du BAC et les fréquents relargages dans les eaux de surface en provenance des équipements de traitement des eaux usées. De plus, le BAC a montré sa toxicité sur les organismes aquatiques, même à faible concentration. Par exemple, pour les poissons, les concentrations létales LC0 (concentration n’entraînant pas de mort) et LC100 (concentration donnant 100 % de mortalité) sont respectivement de 0,5–4mg/L et 2–5mg/L (2–5 × 10−4 %) et pour les daphnies de 0,1mg/L et 1mg/L (10−4 %) avec une LC50  chez le poisson Danio rerio à 96 heures de 0,31mg/L (3,1 × 10−5 %) ; en outre, pour des petits crustacés du genre Daphnia magna, une concentration efficace (EC50), concentration donnant 50 % de réduction de la prolifération, à 48 heures a été déterminée à 0,02mg/L (2 × 10−6 %) et pour les algues d’eau douce, Pseudokirchneriella subcapitala, de 0,07mg/L (7 × 10−6 %) à 72 heures [32].

Impact sur la chaîne légère de la myosine

La phosphorylation de la chaîne légère de myosine est essentielle à la contractilité du cytosquelette d’actine qui joue un rôle essentiel dans la motilité, l’adhésion et le maintien de la polarité cellulaire. L’exposition de cellules de l’épithélium cornéen de bœuf au BAC pendant dix à 20minutes aux concentrations de 0,005, 0,001 et 0,003 % réduit la phosphorylation de la chaîne légère de myosine de plus de 30 % [33]. De plus, le BAC provoque un amincissement de l’actine corticale et une diminution de l’adhésion cellulaire. L’exposition au BAC entraîne aussi une libération accrue d’ATP. La déphosphorylation de la chaîne légère de myosine due à la perte d’ATP est indicative d’une perte de contractilité du cytosquelette d’actine.

BAC et cosmétiques

Le BAC est présent dans très peu de produits cosmétiques. Il existe des restrictions concernant le BAC qui sont mentionnées au journal officiel des communautés européennes. Au numéro d’ordre 54, de la première partie de l’annexe VI de la directive 76/768/CEE du Conseil concernant le rapprochement des législations des Etats membres relatives aux produits cosmétiques, il est mentionné : En tant que conservateur, la concentration maximale autorisée est de 0,1 % calculée en BAC avec la mention obligatoire  : « Eviter le contact avec les yeux ». À l’annexe III, première partie, au numéro d’ordre 65 de la directive 76/768/CEE du Conseil concernant le rapprochement des législations des Etats membres relatives aux produits cosmétiques, il est mentionné : Dans les autres cas, la concentration maximale autorisée pour les produits pour les cheveux, à éliminer par rinçage, est de 3 % de BAC . De plus, dans le produit fini, les concentrations de chlorure, de bromure et de saccharinate de benzalkonium dont la chaîne alkyle est égale ou inférieure à C14, ne doivent pas dépasser 0,1 % de BAC. La concentration maximale autorisée pour les autres produits est de 0,1 %. Dans tous les cas, la mention obligatoire suivante devra être écrite : « Eviter tout contact avec les yeux ».

Effets indésirables en ophtalmologie [1]
Réactions allergiques

L’application répétée et prolongée des conservateurs sur l’œil peut engendrer une sensibilisation et le développement de réactions allergiques. La sensibilisation aux conservateurs a plutôt tendance à augmenter étant donné leur présence, non seulement dans les préparations ophtalmiques, mais aussi dans toute sorte de produits d’usage courant. Les dérivés mercuriels sont fortement allergisants (13 à 37 % des tests cutanés positifs selon les séries) [34, 35]. Les sels de benzalkonium sont considérés comme modérément allergisants (4–11 % selon les séries) [36]. La sensibilisation aux autres conservateurs (chlorhexidine, chlorobutanol) est plus rare. D’un point de vue clinique, l’allergie au conservateur se manifeste généralement par un tableau de conjonctivite ou de blépharite : il peut s’agir d’une simple hyperhémie conjonctivale ou d’une conjonctivite papillaire avec ou sans eczéma des paupières. Les réactions observées sont très souvent des allergies de contact. Il s’agit de réactions retardées d’hypersensibilité de type IV que l’on peut mettre en évidence avec des tests cutanés [37, 38]. La réaction d’hypersensibilité retardée passe par un processus de sensibilisation de 10 à 14 jours, mais se déclenche ensuite dès la huitième heure avec un maximum vers la 48-72e heure. Ce stade est alors marqué par un important œdème épithélial et sous-épithélial, et des infiltrats de cellules de Langerhans et de lymphocytes CD4, avec parfois quelques mastocytes et basophiles. Cette réaction type, rencontrée avec des agents fortement sensibilisants, nécessite parfois de longues durées de sensibilisation, se comptant en mois ou même en année, pour des allergènes moins puissants. La plupart des médicaments ont une masse moléculaire faible, comprise entre 500 et 1000 daltons, et ne sont pas immunogènes directement. Pour le devenir, ils doivent former avec les protéines du sujet des conjugués stables qui seront alors sensibilisants : ils se comportent ainsi comme des haptènes. Un haptène est une substance de faible masse molaire atomique qui, à elle seule, n’entraîne pas la formation d’anticorps mais la provoque lorsqu’elle se combine à une molécule porteuse. Parfois c’est un métabolite ou un produit de dégradation du médicament, voire une impureté, qui constituent l’haptène sensibilisant. Après leur liaison aux membranes cellulaires, certains conservateurs vont pouvoir modifier les protéines cellulaires [39] et induire ainsi une stimulation des cellules immunocompétentes ne tolérant plus l’antigène altéré et le reconnaissant comme étranger. Deux types de réponses immunitaires sont ensuite possibles : soit une sensibilisation de l’organisme envers la partie modifiée de ce nouveau composé appelé adduit, ce qui se manifestera par un phénomène allergique, soit une réponse dirigée contre la partie protéique constante et il en résultera une auto-immunisation avec une production d’auto-anticorps et une réaction cytotoxique [40]. Ces réactions allergiques de contact ont été reproduites expérimentalement chez l’animal [41, 42], comme le cobaye pour le BAC [41] et le lapin pour le thiomersal. Baines et al. [42] ont provoqué chez ce dernier une réaction conjonctivale gigantopapillaire par application d’une lentille de contact contenant des traces de thiomersal. La réaction inflammatoire est caractérisée par une infiltration cornéo-conjonctivale de polynucléaires et de cellules mononucléées. En fonction de la sévérité de la réaction, on peut noter une hyperhémie et un œdème conjonctival, une sécrétion muqueuse significative, un œdème et une néovascularisation de la cornée, une inflammation de l’iris et une infiltration de la chambre antérieure.

Effets toxiques

Les conservateurs sont potentiellement toxiques pour toutes les structures de l’œil, en surface (conjonctive, cornée) ou en profondeur (trabéculum, cristallin, rétine). In vitro, la toxicité des conservateurs a été mise en évidence sur différents types de cellules en culture : cellules épithéliales de la cornée ou de la conjonctive, kératocytes [43, 44, 45] cellules endothéliales de la cornée [43], fibroblastes de la capsule de Tenon [46], cellules trabéculaires [43] ou cellules épithéliales du cristallin [47]. La cytotoxicité des conservateurs in vitro touche plus particulièrement la viabilité cellulaire (altération de l’intégrité de la membrane plasmique ou du métabolisme énergétique mitochondrial) [20, 45, 48, 49], la prolifération [50, 51, 52, 53], ou l’adhésion cellulaire [46] et altère les jonctions serrées comme l’occludine et ZO-1 [53]. Ces effets cytotoxiques augmentent avec la concentration du conservateur et la durée d’exposition. Ils s’observent à des concentrations inférieures à celles présentes dans les préparations commerciales [44, 54]. À fortes concentrations, les conservateurs sont cytotoxiques dans les minutes suivant l’application [49, 50, 55]. Certaines modifications cellulaires sont irréversibles et le retrait du conservateur ne suffit pas toujours au rétablissement des cellules [55, 56, 57]. Les ammoniums quaternaires sont les conservateurs les plus toxiques. Ils provoquent une toxicité similaire in vitro, entraînant une altération précoce de l’intégrité membranaire (15minutes) aux concentrations de 0,005 et 0,01 % [58]. Chez le lapin, la concentration de BAC induisant 50 % de mort cellulaire (LC50) après une heure d’exposition a été estimée à 0,0003 % pour les cellules épithéliales de cornée et à 0,01 % pour les kératocytes en culture primaire [44]. L’effet toxique des conservateurs est très rapide in vitro : en présence de BAC à 0,007 %, la lyse de 50 % des cellules épithéliales en culture survient en moins de 2minutes [56]. L’inhibition de l’adhésion cellulaire peut être observée à des concentrations 40 à 200 fois inférieures aux concentrations des spécialités présentes sur le marché. Par comparaison, le thiomersal peut agir à des concentrations 30 fois inférieures. En utilisant la vidéomicrographie, Tripathi et al. ont montré qu’une simple dose de BAC (0,01 %), de thiomersal (0,001 %) ou de chlorobutanol (0,5 %) produisait une inhibition immédiate de la cytokinèse et de l’activité mitotique de cellules épithéliales cornéennes en culture primaire [57, 59]. La dégénérescence cellulaire est observée après deux heures d’exposition pour le BAC et 9 heures d’exposition pour le chlorobutanol ou le thiomersal. Les études in vitro laissent à penser qu’une grande partie de la toxicité des préparations ophtalmiques disponibles est due aux conservateurs. De Saint Jean et al. [55] ont montré que la viabilité de cellules conjonctivales en culture était bien plus altérée par des préparations de timolol (0,1–0,25 %) contenant du BAC (0,01 %) que par celles sans conservateur. Williams et al. [46] ont montré que la cytotoxicité des préparations de timolol vis-à-vis de la prolifération des fibroblastes de capsule de Tenon en culture primaire était fortement potentialisée par la présence de BAC.

Les conditions expérimentales mises en œuvres in vitro peuvent parfois paraitre exagérées et plus sévères que dans la réalité clinique. Etant donné que la concentration des gouttes ophtalmiques est immédiatement diluée après application dans l’œil par le volume lacrymal basal, la concentration appliquée est ainsi différente de celle réellement en contact avec les cellules cornéo-conjonctivales. Les effets produits in vitro par les conservateurs à faibles concentrations et à très court terme (dans les minutes, voire les secondes suivant l’application du conservateur) sont donc probablement plus proches de la réalité clinique. Un temps d’exposition au BAC de 30 secondes à la concentration de 0,01 % provoque 50 % d’altérations cellulaires, ce qui est proche du temps de contact estimé sur l’œil humain après administration d’une goutte de solution ophtalmique [56, 60]. Aux concentrations inférieures, le temps de contact produisant 50 % de dommage est augmenté (respectivement 90 secondes et 190 secondes pour les concentrations de 0,005 et 0,0025 %). Les expositions prolongées sur plusieurs minutes ou plusieurs heures seraient plus proches d’une utilisation au long cours des collyres dans certaines situations cliniques comme le glaucome ou les syndromes secs.

Mécanismes responsables de la toxicité

Effet détergent

La plupart des conservateurs (ammoniums quaternaires, chlorhexidine, alcools, parabens) sont des détergents. Les ammoniums quaternaires sont les plus cytotoxiques. Ils possèdent une tête hydrophile chargée positivement et une partie non chargée hydrophobe permettant leur ancrage dans les membranes. Les interactions ioniques perturbent fortement la bicouche lipidique des membranes plasmiques. Les conservateurs détergents peuvent ainsi créer des ouvertures pour les substances aqueuses ou ioniques dans les espaces intracellulaires ou intercellulaires [61]. Ces effets suffisent à altérer fortement les cellules épithéliales et à créer une pénétration exagérée de fluide dans le stroma, son hydratation et le développement d’un œdème cornéen [61]. Les réactions sévères que pourraient produire les ammoniums quaternaires sur l’œil sont illustrées par plusieurs études en microscopie confocale qui est devenue une méthode de choix pour l’évaluation de la toxicité oculaire in vivo à un niveau histologique [4, 53, 62, 63, 64, 65]. Chez le lapin et chez le rat, l’effet d’une goutte de surfactant cationique à forte concentration (chlorure de cétyltriméthylammonium à 50 %) sur l’épithélium cornéen produit une irritation sévère avec larmoiement, hyperhémie, photophobie et œdème, associée à une diminution de l’épaisseur de la couche épithéliale de la cornée, un épaississement de la cornée, une lyse des kératocytes et une atteinte de l’endothélium cornéen. Les mécanismes de régénération cellulaire mis en place sont observables après 3 jours : présence de kératocytes, disparition des ponctuations superficielles, présence d’un exsudat de cellules polynucléées au niveau de l’endothélium. Au 35e jour on observe des cellules caliciformes à la surface épithéliale cornéenne, témoignant d’une conjonctivalisation cornéenne pathologique. On note une néovascularisation et une fibrose caractérisée par la présence d’une membrane fibreuse cornéenne.

Nécrose/apoptose

Deux mécanismes de mort cellulaire ont été proposés selon la concentration du conservateur. À de relativement fortes concentrations d’ammoniums quaternaires (0,01 et 0,05 %), la perte de viabilité cellulaire et la mort cellulaire observées dans les cultures de cellules épithéliales conjonctivales humaines mettent en jeu des altérations caractéristiques de nécrose cellulaire [20] : les cellules sont lysées et les débris membranaires sont visibles dans les cultures, les volumes cellulaires sont très faibles et non homogènes, l’ADN sur gel d’agarose présente une migration caractéristique. À plus faible concentration, les ammoniums quaternaires arrêtent la croissance cellulaire et déclenchent un processus de mort programmée. La mort cellulaire est retardée avec des modifications morphologiques et métaboliques caractéristiques de l’apoptose (rétraction cellulaire, condensation de la chromatine, fragmentation de l’ADN et expression de marqueurs apoptotiques) [20]. Des cellules épithéliales cornéennes humaines ont été mises en culture en présence ou non de BAC à différentes concentrations pendant 10minutes. Un marqueur de d’apoptose Apo2.7 a été mesuré 24 heures après par immunofluorescence [49]. En absence de BAC, aucune cellule épithéliale cornéenne humaine n’a exprimé Apo2.7. À une faible concentration de BAC (0,0001 %), 44 % des cellules épithéliales cornéennes humaines ont exprimé le marqueur d’apoptose Apo2.7. À une plus forte concentration de BAC (0,001 %), 69 % des cellules épithéliales cornéennes humaines ont exprimé le marqueur d’apoptose Apo2.7. Celui-ci a été exprimé chez 89 % des cellules épithéliales cornéennes humaines après exposition à une forte concentration de BAC (0,01 %). D’autres modifications métaboliques peuvent être reliées à l’apoptose. Ainsi, Grant et al. [66] rapportent, dans des cultures primaires de cellules épithéliales de cornée de lapin, une diminution de 70 % du calcium intracellulaire et une augmentation significative du pH intracellulaire, associées à une diminution de la viabilité cellulaire après exposition des cellules à faibles concentrations de BAC (0,0001 %).

Stress oxydant

L’anion superoxyde O2 ·− est cytotoxique pour les cellules en culture : il peut dégrader les polysaccharides et l’ADN, modifier la structure des membranes par peroxydation lipidique, altérer la perméabilité vasculaire et potentialiser les réactions inflammatoires. Debbasch et al. [21] ont montré que les collyres contenant des ammoniums quaternaires (0,01 %) produisaient une augmentation significative de la génération d’anions superoxyde par comparaison aux collyres non conservés. La génération de l’anion superoxyde était corrélée à la perte d’intégrité membranaire et à l’apoptose des cellules en présence de BAC. La préincubation d’antioxydant (vitamine E) protégeait les cellules en culture et réduisait de façon significative les dommages membranaires et l’apoptose produits par BAC 0,001 %.

Inflammation

Chez le rat, Baudouin et al. ont montré une infiltration de cellules inflammatoires au niveau de la conjonctive et du trabéculum après instillations de timolol contenant un conservateur pendant un mois [67]. Cette infiltration n’était pas observée avec du timolol non conservé, suggérant fortement le rôle du conservateur dans le développement de la réaction inflammatoire. Il est fort probable que l’application des conservateurs sur la surface oculaire puisse dénaturer les protéines cellulaires et induire une stimulation des cellules immunocompétentes. Les cellules de Langerhans sont présentes au niveau de l’épithélium conjonctival et du chorion cornéo-conjonctival. Elles sont en première ligne lors de l’application de substances ophtalmiques. Après activation, elles pourraient migrer à partir des espaces sous-épithéliaux et entretenir une réaction immuno-inflammatoire et le développement d’une fibrose sous-conjonctivale. Sur des biopsies de conjonctive de patients traités au long cours avec des antiglaucomateux en monothérapie ou multithérapie, Baudouin et al. [67] ont mis en évidence une augmentation significative de l’expression des antigènes HLA-DR, des molécules d’adhésion, en particulier ICAM-3, ainsi que des intégrines bêta-2 (CD 11a et CD 11b) et le CD45RO (phosphatase membranaire exprimée par les cellules immunitaires) dans la substantia propria des patients traités en monothérapie ou plurithérapie par comparaison aux patients jamais traités. Baudouin et al. ont également mis en évidence une expression anormale d’antigènes HLA-DR, de CD23 (récepteur IgE de faible affinité), d’interleukines 6, 8 et 10, des récepteurs CCR4 et CCR5 à la surface des cellules épithéliales sur les empreintes conjonctivale de patients traités avec des antiglaucomateux [15, 68, 69]. En revanche, l’expression des molécules HLA-DR n’était pas augmentée de façon statistiquement significative chez les patients recevant un bêtabloquant non conservé par rapport à des sujets sains sans problème oculaire, suggérant directement le rôle du conservateur dans l’infiltration inflammatoire. La présence d’IL-6 et IL-8 dans les cellules épithéliales conjonctivales exprimant les antigènes HLA-DR souligne le rôle proinflammatoire potentiel de ces cellules.

Altérations du film lacrymal

De par leurs propriétés physico-chimiques les conservateurs détergents sont capables de dissoudre la couche lipidique du film lacrymal. Cela conduit à une rupture rapide du film lacrymal facilitant l’évaporation de l’eau et produisant une sécheresse oculaire. Ainsi, l’instillation de trois gouttes de BAC produit une diminution de plus de 50 % du temps de rupture du film lacrymal, même a très faible concentration (0,001 %) [70]. Le BAC est plus agressif que la chlorhexidine, le chlorobutanol ou le thiomersal. À des concentrations supérieures à 0,005 %, sa tension de surface est inférieure à celle du film lacrymal [71], ce qui empêche l’étalement des sécrétions lipidiques issues des glandes de Meibomius sur la surface de la phase aqueuse du film lacrymal [72]. Une réduction significativement plus marquée du temps de rupture du film lacrymal a pu être mise en évidence par Pisella et al. [73] chez des lapins albinos traités pendant 60 jours avec un collyre bêtabloquant conservé, en comparaison avec des lapins traités avec un bêtabloquant sans conservateur. Chez l’homme, le même constat a été fait chez des volontaires sains traités avec du cartéolol conservé ou non conservé [67].

Altérations de la conjonctive induites par le BAC

L’instillation de conservateurs sur la conjonctive peut avoir plusieurs conséquences étroitement liées (Tableau 3, Tableau 4) : cytotoxicité, activation d’une réaction immuno-allergique infraclinique, développement d’une fibrose sous-conjonctivale, pouvant aboutir à une cicatrisation conjonctivale progressive [74]. Les conséquences sur le système lacrymal (perte de cellules à mucus, dissolution de la composante lipidique du film lacrymal, sécheresse oculaire) peuvent être sérieuses et conduire à une sécheresse oculaire elle-même péjorative pour la conjonctive et la cornée. Une diminution de la densité des cellules à mucus a été observée à la suite d’instillations de collyres contenant un conservateur aussi bien chez l’homme [75] que chez l’animal [76]. La première conséquence de cette perte cellulaire est une modification de la composition et de la qualité du film lacrymal. Une étude pharmacocinétique chez le lapin après une seule instillation [77] a montré que la demi-vie du BAC est de 20 heures sur la conjonctive et que des résidus de BAC sont détectés au niveau de l’épithélium conjonctival neuf jours après une administration unique de conservateur. Dans les expériences réalisées in vitro sur cultures de cellules épithéliales conjonctivales, le BAC à faibles concentrations, de l’ordre de 10−4 %, n’a pas d’effet nocif sur l’homéostasie cellulaire. En revanche aux concentrations de l’ordre de 10−1 à 5.10−2 %, une lyse cellulaire importante survient dès les trois premières heures, tandis qu’entre 10−2 % (concentration des collyres) et 10−4 %, les effets sont retardés et progressifs en fonction de la concentration, ce conservateur pouvant induire soit une apoptose soit une nécrose cellulaire. Becquet et al. [76] ont mis en évidence chez le rat traité pendant un mois avec différentes solutions de conservateur (en particulier BAC 0,01 %, méthylparahydroxybenzoate 0,05 % et thiomersal 0,004 %), une infiltration de cellules immunocompétentes au niveau du limbe et de la conjonctive bulbaire. Les cellules exprimaient en particulier les antigènes membranaires HLA de classe II et CD11b (intégrine leucocytaire). Cette réaction était également associée à une forte altération de la surface oculaire : perte des cellules caliciformes, kératinisation, et augmentation des couches épithéliales superficielles. Des résultats similaires ont été rapportés par Baudouin et al. chez des rats traités avec du timolol 0,05 % contenant du BAC 0,01 % [67]. Par comparaison le timolol non conservé n’a pas produit de modification histopathologique significative par rapport aux animaux contrôles, ce qui confirme qu’une grande partie de la toxicité des préparations commerciales est due au conservateur. De même Noecker et al. ont mis en évidence une infiltration de lymphocytes dans les différentes couches conjonctivales (épithélium, stroma superficiel et profond) chez des lapins traités pendant 30 jours par différentes préparations antiglaucomateuses contenant du BAC [78]. L’infiltration de fibroblastes et l’installation d’une fibrose chronique produite par les conservateurs ont été suggérées par différentes études effectuées chez l’animal. Mietz et al. ont ainsi montré que l’instillation de métipranolol 0,3 % conservé avec du BAC (une goutte deux fois par jour pendant six mois), produisait une altération de la composition de la matrice extracellulaire et de l’organisation du stroma conjonctival, associée à une augmentation sous-épithéliale du nombre de fibroblastes activés, de dépôt de collagène et de l’épaississement de la membrane basale de l’endothélium [79]. Des résultats similaires sont observés avec la pilocarpine 2 % conservé dans du chlorure de cétrimonium 0,004 % [80]. Ces changements paraissent permanents et irréversibles et pourraient être dus en partie aux conservateurs [80]. Ces études corroborent les premiers résultats publiés par Young et al. [81] montrant une augmentation de la prolifération fibroblastique conjonctivale après chirurgie filtrante chez des lapins préalablement traités avec des collyres contenant des conservateurs (timolol 0,5 %, pilocarpine 4 %, ou larmes artificielles). Les empreintes conjonctivales de patients traités au long cours avec des antiglaucomateux présentent des caractéristiques bien déterminées [82].

Les couches épithéliales conjonctivales désorganisées, la perte de la cohésion tissulaire, la modification de la morphologie des cellules épithéliales, la kératinisation et la perte de cellules à mucus, signent la métaplasie cellulaire. Les patients traités au long cours présentent en effet une métaplasie de l’épithélium conjonctival par rapport à des glaucomateux non traités [83] ou à des sujets témoins sans anomalie oculaire [75]. La métaplasie épithéliale est observée sur les conjonctives palpébrale et bulbaire [83]. Les modifications histomorphologiques de l’épithélium peuvent apparaître rapidement, deux semaines après le début d’un traitement antiglaucomateux [84]. En revanche, Turaçli et al. ne retrouvent aucune relation entre le degré de la métaplasie et la durée du traitement antiglaucomateux chez des patients traités depuis plus de trois mois [85]. Mais plusieurs études ont clairement établi une association entre le nombre de collyres antiglaucomateux utilisés et le degré de la métaplasie épithéliale [83, 86]. La perte de cellules à mucus est le premier signe de la métaplasie squameuse, suivie par une augmentation de la stratification cellulaire, puis par la kératinisation [82]. Les patients traités au long cours avec des collyres antiglaucomateux présentent souvent une diminution significative des cellules à mucus en comparaison avec des patients glaucomateux non traités [87] ou des sujets sains sans anomalie oculaire [75]. Les conservateurs, le BAC en premier, sont fortement suspectés de provoquer ou d’entretenir les modifications morphologiques épithéliales observées lors de l’utilisation des collyres antiglaucomateux. Dans une étude randomisée croisée, il a été montré que les modifications morphologiques des empreintes conjonctivales produites par l’instillation du timolol conservé, à raison de deux fois par jour pendant deux semaines, étaient inférieures aux altérations produites par l’instillation de latanoprost (une fois par jour) conservé par du BAC à une concentration double (0,02 %) [84].

Le développement d’une fibrose sous-conjonctivale progressive en l’absence de signe clinique d’intolérance est également documenté et assez fréquent chez les patients traités avec des collyres antiglaucomateux au long cours [88]. L’infiltration de cellules inflammatoires observée chez ces patients est généralement associée à une augmentation significative de la densité des fibroblastes dans la substantia propria sous-épithéliale [67, 87]. Baudouin et al. ont analysé par immunohistochimie des biopsies conjonctivales et trabéculaires de patients traités par des collyres antiglaucomateux conservés ou non conservés. Ils ont montré une augmentation significative de l’expression de marqueurs fibroblastiques et inflammatoires, plus prononcée chez les patients multitraités [67].

Cytotoxicité cornéenne

L’instillation de collyres contenant des conservateurs peut produire des modifications morphologiques de la cornée telles qu’une perte des microvillosités ou la rupture des jonctions intercellulaires augmentant la perméabilité et la pénétration des solutions ioniques, des substances lipophiles et des microorganismes. Les conséquences sur un œil malade peuvent être sérieuses : épaississement de la cornée, atteinte de l’endothélium, opacité cornéenne. Les expériences menées par Furrer et al. ont montré que l’instillation des conservateurs (ammonium quaternaires, dérivés mercuriels, alcools, chlorhexidine, parabens) chez la souris produisait des microlésions mises en évidence par coloration à la fluorescéine [89]. Chez le lapin, l’application de bêtabloquant conservé avec du BAC 0,01 % ou du bromure benzododécinium 0,012 % produit des microlésions pouvant couvrir près de 15 % de la surface cornéenne après 28 jours de traitement (une ou deux gouttes par jour). Cet effet a été attribué au conservateur, les bêtabloquants non conservés ne produisant pas de toxicité particulière [90]. Imayasu et al. ont montré que l’instillation répétée (deux gouttes à cinqminutes d’intervalle pendant une heure) de BAC (de 0,005–0,02 %) ou de chlorhexidine (0,01–0,03 %) produit un relargage de lactate déshydrogénase et d’albumine dans les larmes chez le lapin, signe de souffrance cornéenne et corrélé aux lésions de la surface oculaire observées à la lampe à fente [91]. Chez le lapin, un contact prolongé (1,5–3 heures) de la cornée avec des larmes artificielles contenant du BAC (0,01 %) augmente d’un facteur 10 à 100 la captage de carboxyfluorescéine (plus hydrophile que la fluorescéine et présentant une pénétration restreinte dans les espaces péricellulaires) [92]. Les larmes artificielles contenant du thiomersal 0,004 % et du polyquad 0,001 % augmentent également ce captage, mais d’une façon plus modérée (jusqu’à quatre fois). En utilisant du rouge de ruthénium (un colorant se fixant sur les groupements anioniques des mucopolysaccharides à la surface des membranes latérales des cellules épithéliales), Lopez Bernard et al. ont pu mettre en évidence une destruction complète de la barrière épithéliale avec une perte des couches cellulaires les plus superficielles [92]. Le contact du BAC 0,01 % sur les yeux de lapin a produit une accumulation du rouge de ruthénium dans les espaces intercellulaires de toutes les couches épithéliales, indiquant une pénétration en profondeur du BAC. Les cellules avaient perdu leur morphologie normale et contenaient de nombreuses vacuoles. En revanche, pour les autres conservateurs étudiés (thiomersal 0,004 %, polyquad 0,001 %), la coloration était restée localisée à la surface des couches superficielles. Le niveau de pénétration du ruthénium après exposition au BAC indique que les cornées altérées pourraient ainsi être plus sensibles à l’invasion de pathogènes.

L’application répétée de BAC sur la cornée peut causer une perte de cellules jusqu’aux couches les moins différenciées de l’épithélium et retarder, voire inhiber la régénération cellulaire et la réparation de la barrière épithéliale. Dans un modèle expérimental de lésions, créées in vitro sur une monocouche de cellules épithéliales de cornée de chien en culture primaire, les cellules épithéliales à la périphérie de la lésion présentent de façon caractéristique des pseudopodes s’étendant vers les lésions [93]. On peut observer une diminution progressive de la superficie de la lésion dans les cultures non exposées au BAC 0,0025 % ou au timérosal 0,025 %. Dans les cultures contenant du BAC, les cellules ne développent pas de pseudopodes et la migration est inhibée [93]. Le processus de réépithélialisation est facilité par l’accrochage des cellules à la matrice extracellulaire. Salonen et al. ont montré que le BAC et le thimérosal à des concentrations 40 à 200 fois inférieures aux concentrations utilisées dans les préparations commerciales pouvaient inhiber l’adhérence des cellules à une couche de fibronectine et compromettre ainsi le processus de réparation cornéenne [54]. Les expériences effectuées chez le lapin après kératectomie montrent un retard de cicatrisation lorsque les yeux sont exposés au BAC 0,01 % en présence d’EDTA 0,1 % [94]. À plus forte concentration (0,02 %), l’amélioration de la taille des lésions reste partielle au sixième jour. La guérison complète nécessite l’arrêt des instillations de BAC 0,02 %. Ces résultats suggèrent que le traitement des ulcères cornéens avec des substances contenant un conservateur pourrait contribuer à une diminution de la ré-épithélialisation. Klip et al. rapportèrent le cas d’une femme de 46 ans instillant, pour un syndrome sec, des larmes artificielles contenant du BAC toutes les deux heures, puis toutes les 30minutes, qui a développé une kératite superficielle avec une hyperplasie épithéliale en vagues [95]. La kératopathie a régressé au bout d’une semaine après l’arrêt du conservateur. Les tests cutanés effectués n’ont pas montré d’allergie au BAC. Bien que dans la plupart de ces kératopathies toxiques l’endothélium cornéen ne soit pas endommagé, Lemp et al. rapportèrent le cas d’une endothéliopathie toxique sévère clairement due au BAC chez un homme présentant une kératoconjonctivite sèche bilatérale, traitée plusieurs années par l’instillation de larmes artificielles contenant du BAC [96]. Ce patient montait une dégénérescence avancée de la cornée nécessitant une kératoplastie. L’histopathologie du bouton cornéen excisé a révélé une fibrose stromale et un œdème cornéen. Apres l’opération, les symptômes du patient ont persisté jusqu’à ce que la médication conservée soit définitivement remplacée par une solution saline ne contenant pas de conservateur. Une amélioration spectaculaire des symptômes a été observée au bout de deux semaines. Lors des anesthésies générales, la cornée est particulièrement sensible à la diminution de la production lacrymale, à la diminution de la stabilité du film lacrymal, à la lagophtalmie. Des lubrifiants oculaires sont souvent prescrits. Manecke et al. rapportent une agression cornéenne sévère (hyperhémie conjonctivale, vision floue, photophobie, diminution bilatérale de l’acuité visuelle) accompagnée de maux de tête lors d’une anesthésie chez un homme de 47 ans ayant reçu un lubrifiant oculaire contenant du chlorobutanol 0,5 %, un conservateur théoriquement moins toxique que le BAC [97]. La coloration à la fluorescéine a révélé des zones désépithélialisées. Les symptômes se sont améliorés après trois jours de traitement avec des antibiotiques et des anti-inflammatoires topiques ainsi qu’un lubrifiant non conservé. Liu et al. rapportent des œdèmes cornéens permanents par atteinte endothéliale sur une série de patients ayant subi une chirurgie de la cataracte par phacoémulsification [98]. Les recherches effectuées après la chirurgie ont mis en cause l’administration accidentelle d’une solution contenant du BAC à 0,013 % dans la chambre antérieure des patients lors de la chirurgie. L’amélioration de l’acuité visuelle ne s’est manifestée que chez un seul patient après six mois. Les altérations cornéennes observées incluaient des plis de la membrane de Descemet et une augmentation de l’épaisseur du stroma cornéen [99].

Complications de la chirurgie du glaucome

L’échec de la chirurgie du glaucome est pour une part liée à l’ancienneté et à l’importance du traitement médical préalable, et cette constatation a fait proposer le recours précoce à la chirurgie. Cependant la présence de signes histologiques d’inflammation conjonctivale est plus fréquente chez les patients glaucomateux traités par collyres au long cours (plus de trois ans), et certains échecs de la chirurgie semblent liés à la présence d’une inflammation de la surface oculaire [100]. Il est donc probable que la toxicité des conservateurs joue également un rôle important dans les échecs de la chirurgie du glaucome. Malgré les performances des chirurgies filtrantes, le succès de ces interventions chirurgicales est très variable, souvent décevant [101]. Dans une série de 106 chirurgies filtrantes, Broadway et al. rapportent un taux de réussite de 90 % chez les patients ayant subi une trabéculectomie primaire (patients non traités), de 93 % chez des patients traité par bêta-bloquant en monothérapie, de 72 % chez les patients recevant un bêtabloquant et un myotique et de seulement 45 % chez ceux recevant un myotique et un sympathomimétique [100]. En outre, le taux de succès était significativement plus bas chez les patients traités depuis plus de trois ans (55 %), comparés aux autres patients (94 %, p <0,001), suggérant que la durée du traitement antiglaucomateux et le nombre de traitements sont liés au résultat de la chirurgie filtrante. Lavin et al. rapportèrent, dans une étude rétrospective, un taux de réussite particulièrement élevé (97,9 %) chez les patients n’ayant reçu aucun traitement antiglaucomateux au long cours [102]. Par comparaison, les patients traités depuis au moins un an avec une association de plusieurs antiglaucomateux avaient un taux de réussite statistiquement inférieur (79,1 %, p <0,001). Cette étude montre également que l’association de plusieurs traitements antiglaucomateux multiplie par cinq le risque d’échec des chirurgies filtrantes. Il est admis que la principale cause d’échec de la chirurgie filtrante est le développement exacerbé d’une fibrose locale de la bulle qui empêche le passage de l’humeur aqueuse [103, 104]. Une thérapie médicale intensive pourrait favoriser l’infiltration de cellules inflammatoires et la prolifération de fibroblastes augmentant, ainsi, le risque de cicatrisation fibreuse et d’échec de la chirurgie filtrante. Sherwood et al. ont montré une infiltration significativement augmentée de cellules inflammatoires, de fibroblastes et de corps hyalins dans la substantia propria de la conjonctive et dans les couches de la capsule de Tenon chez des patients glaucomateux traités au long cours (plus d’un an) [87], en comparaison avec des patients ayant subi une trabéculectomie de première intention. Baudouin et al. ont également mis en évidence une infiltration de cellules inflammatoires et de fibroblastes sur des biopsies de conjonctive et des trabéculums de patients traités avec des collyres antiglaucomateux [67]. Dans une autre étude, Broadway et al. ont établi une relation directe entre la durée et l’importance du traitement antiglaucomateux, le profil cellulaire de la conjonctive (en particulier les cellules inflammatoires) et le résultat de la chirurgie filtrante [100].

Atteinte des tissus oculaires profonds : le trabéculum

Dans certaines situations, notamment lorsque la surface cornéo-conjonctivale est fortement atteinte, la pénétration des collyres et donc du conservateur peut être augmentée et toucher les tissus profonds de l’œil. Les cellules trabéculaires semblent très sensibles aux conservateurs. In vitro, le BAC inhibe la croissance des cellules trabéculaires humaines après sept jours d’exposition à des concentrations particulièrement faibles (10−7 à 10−5 %) [43]. Le BAC peut induire l’apoptose des cellules trabéculaires après une courte exposition (15minutes) à faible concentration (0,0001 %). Cet effet est spécifique du BAC, puisque l’apoptose n’est pas déclenchée dans les cultures de cellules exposées à des collyres non conservés [105].

Le cristallin

Des taux de cataracte significativement plus élevés ont été retrouvés dans l’étude OHTS (ocular Hyper-Tension Study) et diverses études épidémiologiques, faisant suspecter les traitements antiglaucomateux et plus particulièrement le BAC [106]. In vitro, Goto et al. ont montré que le BAC exerçait de façon dose-dépendante, un effet toxique vis-à-vis des cellules de cristallin humain en induisant fortement l’expression de médiateurs chimiques solubles (PGE2, IL-1, et IL-6) [47].

La rétine

Les patients recevant un traitement antiglaucomateux au long cours, développent plus facilement des œdèmes maculaires cystoïdes après une opération de la cataracte [107]. Cet effet est observé avec différents types de collyres (épinéphrine, dipivéfrine, timolol et latanoprost) contenant un conservateur. Les causes de cette induction ne sont pas très bien établies. Un lien avec les réactions inflammatoires a récemment été suggéré. Le mécanisme vraisemblablement mis en jeu inclut la libération de médiateurs pro-inflammatoires (prostaglandines, cytokines) lors de la chirurgie [107]. Chez des lapins pigmentés, l’injection sous-conjonctivale (200μl par jour pendant deux semaines) de collyres (timolol 0,5 % ou befunolol 1 %) contenant du BAC produit des lésions rétiniennes mises en évidence sur l’électrorétinogramme par une diminution de moitié de l’amplitude des ondes a et b après une semaine d’exposition [108]. On observe ensuite un décollement de la rétine, une perte d’acuité visuelle et l’atrophie de l’épithélium pigmentaire de la rétine et de la choroïde. On observe plus particulièrement la disparition des granules de mélanine des cellules épithéliales pigmentaires et la disparition des segments internes et externes des cellules photoréceptrices. Ces effets semblent spécifiques du conservateur, puisque les collyres de timolol ou de befunolol non conservés n’ont montré que des effets non significatifs.

Conclusion

L’utilisation des conservateurs en ophtalmologie est un important problème de santé publique car les conservateurs présents dans les collyres sont utilisés par une large catégorie de patients. En effet, les patients présentant une sécheresse oculaire, des allergies oculaires fréquentes, des infections oculaires, ceux présentant un glaucome sont souvent traités avec des médications topiques contenant la plupart du temps des conservateurs. Le BAC est le conservateur le plus fréquemment utilisé dans les collyres classiques dits multidoses ou dans les solutions nasales pour prévenir toute contamination bactérienne. L’instillation oculaire quotidienne, répétée, s’étendant sur plusieurs mois ou années, de solutions contenant du BAC qui a des propriétés cytotoxiques et détergentes provoque des effets néfastes non seulement sur le film lacrymal mais également sur les différentes structures de la cornée et de la conjonctive et des tissus annexes comme les paupières. Le BAC provoque, en outre, un ralentissement des processus de cicatrisation des épithéliums. Il modifie l’équilibre de la flore bactérienne lacrymale et entraîne une déstabilisation du film lacrymal directement par ses effets sur la phase lipidique et indirectement en diminuant le nombre de cellules à mucus. Il induit des réactions allergiques et toxiques sur l’épithélium cornéen, se manifestant sous forme de desquamation, nécrose ou œdème. Pour le malade, ces phénomènes se traduisent par des picotements, des brûlures, un prurit, une sensation de sécheresse oculaire, une allergie. De plus, le cas des collyres antiglaucomateux est particulièrement préoccupant puisqu’ils doivent être instillés au long cours, durant toute la vie, et peuvent ainsi compromettre, par les altérations de la surface oculaire, le pronostic fonctionnel d’une éventuelle chirurgie de filtration, devenue indispensable après échec du traitement médical. Le BAC ne concerne pas seulement le domaine ophtalmologique, il est présent très largement dans de nombreuses formulations thérapeutiques notamment dans les décongestionnants nasaux où il participe à l’aggravation de la rhinite médicamenteuse. Il est retrouvé dans l’environnement pour lequel il représente désormais un danger car son important relargage dans les eaux de surface conduit à la mort des espèces aquatiques. Enfin, l’utilisation à grande échelle en particulier dans la chaîne alimentaire depuis de nombreuses années de désinfectants comme le BAC a conduit à l’apparition non seulement de phénomènes de résistance bactérienne à ce conservateur, mais aussi et surtout de résistance aux antibiotiques. Une prise de conscience globale des dangers de l’utilisation large des conservateurs n’est pas encore suffisante devant l’ampleur de la tâche qui attend les toxicologues avec le programme REACH. Les conservateurs semblent pour le moment passer au second plan face à des toxiques plus largement répandus et dont la toxicité est réputée plus grave. Cependant, le problème des conservateurs est sérieusement considéré en ophtalmologie depuis plus d’une dizaine d’années où les cliniciens et industriels collaborent étroitement afin de résoudre un véritable cercle vicieux qui, partant d’une pathologie à traiter, conduit inexorablement à l’apparition d’une autre pathologie, iatrogène, de la surface oculaire.

Le meilleur moyen de limiter ces complications oculaires passe par l’utilisation de collyres sans conservateur, lorsqu’elle est possible, à défaut en privilégiant les associations fixes pour limiter l’impact des multithérapies et en préférant les collyres à instillation uniquotidienne. Cela devrait permettre d’augmenter le confort du patient, l’observance au traitement et d’assurer une meilleure efficacité de la prise en charge et le succès d’une future chirurgie filtrante. Cependant, les unidoses sont plus onéreuses à la fabrication et moins écologiques que les multidoses. Certains laboratoires ont mis au point des conditionnements de collyres multidoses sans conservateur comme, par exemple, le système ABAK® ou le système COMOD®, qui équipent des flacons multidoses pouvant être utilisés un et trois mois, sans instillation de conservateur toxique pour l’œil. Ces systèmes d’administration de collyres, tout à fait intéressants, présentent cependant l’inconvénient d’être limités à un nombre restreint de molécules. Enfin, malgré l’abondance de collyres contenant un conservateur, des efforts sont manifestes pour contourner et éviter les effets toxiques du benzalkonium. Un intérêt est porté à des excipients déjà utilisés dans les substituts lacrymaux et qui pourraient atténuer ces effets comme des carbomères ou des hyaluronates [58, 109]. L’arrivée sur le marché international de nouvelles formulations avec des conservateurs moins toxiques que le BAC, comme le polyquaternium-1, le perborate de sodium (NaBO3 ) ou le chlorite de sodium (NaClO2 , ou Purite®), ou utilisant la technologie des émulsions [64], marque une étape décisive dans la prise de conscience des effets délétères des conservateurs. L’industrie pharmaceutique, en partenariat avec les médecins et les chercheurs impliqués dans les pathologies chroniques les plus affectées par cette toxicité, continuera les recherches afin d’assurer aux patients le traitement le plus approprié à leur pathologie sans induire d’effet nuisible.

Conflit d’intérêt

Aucun.

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